Il mondo nascosto delle cellule, Nobel alla microscopia ad alta risoluzione

Fin dal XVII secolo, quando il primo microbiologo Antonie van Leeuwenhoek concentrò la luce attraverso alcune lenti e vide per la prima volta meravigliato, le cellule che nuotavano davanti ai suoi occhi, i microscopi hanno aperto nuove prospettive di scoperta. Quest’anno, il premio Nobel per la chimica è andato a tre scienziati che hanno sfidato i limiti dei microscopi ottici per rivelare le immagini nitide di strutture su scala molecolare nelle cellule viventi.

I progressi compiuti da Stefan Hell, William Moerner e Eric Betzig, negli anni novanta e duemila significano che biologi possono vedere ora, in tempo reale, come le proteine sono distribuite e si muovono all’interno delle cellule, alle giunzioni tra neuroni, ad esempio, o nelle uova fecondate che si dividono in embrioni.

“È davvero una rivoluzione per le scienze della vita, perché possiamo vedere le strutture che non abbiamo mai potuto vedere prima,” dice Stefan Jakobs, che lavora con tecniche di super-risoluzione presso l’Istituto Max Planck per la chimica biofisica a Gottinga. O come il Comitato del Nobel ha ammesso: “La microscopia è diventata nanoscopia.”

Non importa quanto pulite siano le loro lenti, i microscopi ottici forniscono inevitabilmente una visione sfocata delle molecole all’interno delle cellule, come il fisico tedesco che Ernst Abbe comprese nel 1873. Le leggi della fisica impongono che la luce visibile non può distinguere tra gli oggetti più vicini gli uni agli altri di circa 200 nanometri (circa la metà della lunghezza d’onda della luce visibile), appaiono come un blob. Tale risoluzione, nota come limite di diffrazione di Abbe, è abbastanza buona per rivelare gli organelli all’interno delle cellule, ma non per vedere le loro strutture dettagliate. I microscopi che utilizzano fasci di elettroni, anziché la luce, hanno una risoluzione più sottile, ma possono essere utilizzati solo nel vuoto, limitando il loro uso a tessuti morti.

Il limite di Abbe sembrava essere destinato a non essere superato, ma i vincitori dei premi Nobel 2014, hanno sviluppato i modi per aggirarlo utilizzando i fluorofori, o molecole fluorescenti. Ora abitualmente utilizzati nell’imaging biologico, i fluorofori emettono luce quando vengono colpiti dal laser di una certa lunghezza d’onda.

Nel 1989, William Moerner, ora all’Università di Stanford in California, ma allora presso il centro di ricerca IBM Almaden a San Jose, ha rilevato la debole fluorescenza di una singola molecola. Nel 1997, mentre lavorava presso l’Università della California a San Diego, ha trovato un modo per controllare la fluorescenza e accendere o spengere le molecole come delle lampade. Eppure, queste singole molecole potevano essere distinte solo se erano a più di 200 nanometri di distanza.

Due anni prima, Eric Betzig, che era al tempo lavorava presso i laboratori Bell di Murray Hill, New Jersey, aveva proposto che se diverse molecole all’interno di una cellula potevano essere fatte brillare con colori diversi, i ricercatori avrebbero potuto essere in grado di aumentare la risoluzione prendendo una serie di istantanee, prima le molecole rosse, poi le verdi, poi le blu. Qualsiasi fluorofori dellostesso colore avrebbe dovuto essere a più di 200 nanometri di distanza, ma le immagini sovrapposte avrebbero prodotto una struttura a risoluzione molto più fine. Moerner ha continuato a dimostrare che le molecole identiche potevano essere rese a fluorescenza in tempi diversi, una scoperta che alla fine ha fatto sì che la visione di Betzig divenisse una realtà.

Ci sarebbe voluto un decennio prima che Betzig potesse realizzare la sua idea in pratica. Ha lasciato la scienza accademica per lavorare nel commercio di macchine utensili di suo padre nel Michigan. Nel 2006, lavorando presso il campus di ricerca dell’Howard Hughes Medical Institute Janelia Farm di Ashburn, in Virginia, ha usato la tecnica per scattare una foto di super-risoluzione di una proteina di lysosome costellata di molecole fluorescenti verdi come etichette. La tecnica può ora arrivare ad una risoluzione di 20 nanometri, afferma Markus Sauer, che studia la microscopia di super-risoluzione presso l’Università di Würzburg, in Germania.

Intanto Stefan Hell, mentre lavorava presso l’Università di Turku in Finlandia, aveva trovato un modo per aggirare il limite di Abbe con una tecnica diversa, che si basa pure sul passaggio di molecole fluorescenti on e off. Nel 1994 ha proposto l’utilizzo di un laser per fare un ammasso di molecole fluorescenti, e un secondo fascio, ed un secondo fascio, di una lunghezza d’onda diversa, per passare alcuni di questi fluorofori off – attraverso un processo descritto da Einstein nel 1917.

Il trucco di Hell è quello di utilizzare il secondo raggio per delineare l’ammasso illuminato dal primo, così che solo le molecole in un posto molto stretto reagiscono. L’immagine finale rimane offuscata, come descrive il limite di Abbe, ma è chiaro che la luce può provenire solo da uno stretto posto centrale definito dal secondo raggio, consentendo ai ricercatori di individuare la fonte della luce stessa.

Costruendo una serie di queste piccole macchie fluorescenti, si crea un’alta risoluzione. In teoria, il punto centrale può essere rimpiccioliti a pochi nanometri, ma nelle cellule viventi, il limite è di circa 30 nanometri, Sauer dice, perché è in questa fase che i fluorofori sono generalmente distrutti dall’intensità del secondo fascio.

“È stato il mio punto di vista, almeno, che per la fisica del ventesimo secolo fosse impossibile non ci fosse nessun fenomeno che permettesse di superare la barriera di diffrazione,” dice Hell, che ora lavora presso l’Istituto Max Planck per la chimica biofisica a Göttingen.

Infatti, ogni principio di fisica quantistica che Hell ha utilizzato era stato scoperto dai fisici dalla fine degli anni venti, nota Thomas Klar, capo dell’Istituto di fisica applicata alla Johannes Kepler University Linz, Austria, che è co-autore della carta delle linee di principio con Hell nel 2000.

La chiamata del comitato Nobel è arrivata mentre Hell stava leggendo un articolo scientifico. In seguito, ha detto, “ho letto il paragrafo che ho voluto leggere fino alla fine, poi ho chiamato mia moglie e ho cercato di raggiungere alcune delle persone che sono vicino a me.”

Le tecniche ideate da vincitori di quest’anno non sono ancora routine ma sono utilizzate da molti biologi per scattare foto particolari di strutture all’interno delle cellule. Hell ha pubblicato il video delle vescicole 40 nanometri attraverso lo spostamento in una cellula del nervo. Xiaowei Zhuang, un chimico all’Università di Harvard, Cambridge, Massachusetts, ha inventato la propria variante, denominata microscopia ottica stocastica di ricostruzione che ha usato per mostrare come i filamenti di actina si avvolgono intorno alla circonferenza degli assoni in un modello anulare. “Ci saranno molte nuove versioni di microscopi a super-risoluzione in futuro,” dice Hell.

 
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